Aktorka zdobyła statuetkę dla Najlepszej Aktorki Drugoplanowej za rolę w filmie „Vicky Cristina Barcelona”.
W 1991 roku zadebiutowała na wielkim ekranie w filmie El Laberiento Griego. Rok później zagrała w m.in. „Szynka, szynka” i „Belle époque”. Za rolę w drugim z filmów dostała nagrodę Goya – hiszpański odpowiednik Oscara.
W 1999 r. wystąpiła w filmie Pedro Almodóvara Todo sobre mi madre (pol. Wszystko o mojej matce). Film ten został nagrodzony Oskarem dla najlepszego filmu obcojęzycznego. W 2000 roku zagrała razem z Mattem Damonem w filmie All the Pretty Horses (pol. Rącze konie). Na początku 2001 r. wystąpiła wraz z Tomem Cruisem w filmie Vanilla Sky. W 2005 roku aktorka wystąpiła w filmie Sahara u boku Matthew McConaughey z którym miała trwający rok romans.
Z Salmą Hayek (aktorka przyjaźni się z nią od 2001 roku) w 2006 r. zagrała w filmie SEXiPISTOLS. W tym samym roku Penélope zagrała ponownie w filmie Almodóvara – Volver. Za tę rolę otrzymała Złotą Palmę w Cannes dla najlepszej aktorki, a także nominację do Oscara w kategorii najlepsza aktorka pierwszoplanowa. W 2009 roku ponownie zostaje nominowana do Oscara, lecz już jako najlepsza aktorka drugoplanowa (za rolę w filmie Vicky Cristina Barcelona w reżyserii Woody’ego Allena), nagrodę otrzymała, jako pierwsza w historii Hiszpanka.
